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技術(shù)原理

晚期凋亡細(xì)胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化下，將帶有熒光素分子的dUTP標(biāo)記到DNA的3'-末端，然后通過(guò)熒光顯微鏡觀察、或進(jìn)而用帶有HRP的一抗染色后DAB顯色，可以進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。

Tunel檢測(cè)可以標(biāo)記組織細(xì)胞中發(fā)生凋亡的細(xì)胞，通過(guò)核復(fù)染計(jì)數(shù)細(xì)胞比例，可以計(jì)算一定組織細(xì)胞中發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例，常用在各方向生物學(xué)研究中凋亡發(fā)生的檢測(cè)以及定性比較。

實(shí)驗(yàn)流程

石蠟切片/冰凍切片/細(xì)胞爬片-脫蠟-通透-酶標(biāo)記反應(yīng)-HRP抗體,DAB顯色，可白光拍照-核復(fù)染-觀察拍照。

實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片

a. PBS或HBSS洗滌一次。

b. 如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。

c. 用4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液(P0098)固定細(xì)胞30-60分鐘。

d. 用PBS或HBSS洗滌一次。

e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。

f. 轉(zhuǎn)步驟5。

對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a. 收集細(xì)胞(不超過(guò)200萬(wàn)細(xì)胞)，PBS或HBSS洗滌一次。

b. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。為防止細(xì)胞聚集成團(tuán)，宜在側(cè)擺搖床或水

平搖床上緩慢搖動(dòng)的同時(shí)進(jìn)行固定。

c. 用PBS或HBSS洗滌一次。

d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，冰浴孵育2分鐘。

e. 轉(zhuǎn)步驟5。

對(duì)于石蠟切片

a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無(wú)水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。

b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的作用溫度和時(shí)間需自行摸索)。

c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

d. 轉(zhuǎn)步驟5。

對(duì)于冷凍切片

a. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。

b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。

c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。

d. 轉(zhuǎn)步驟5。

對(duì)于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片

a. 用PBS或HBSS洗滌2次。

b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時(shí)需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤(rùn)，以盡量減少TUNEL檢測(cè)液的蒸發(fā)。

c. PBS或HBSS洗滌3次。

d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565nm(綠色熒光)。

對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a. 用PBS或HBSS洗滌2次。

b. 加入50μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60分鐘。

c. PBS或HBSS洗滌2次。

d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。

e. 此時(shí)可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范

圍為515-565nm(綠色熒光)。

樣本保存運(yùn)輸