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一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1、了解透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)和工作原理。

2、了解透射電子顯微鏡樣品制備的方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理.

透射電子顯微鏡是以波長(zhǎng)極短的電子束作為照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種高分辨

本領(lǐng)、高放大倍數(shù)的電子光學(xué)顯微鏡。透射電鏡的總體工作原理是:由電子槍發(fā)射出來的電

子束，在真空通道中沿著鏡體光軸穿越聚光鏡，通過聚光鏡將之會(huì)聚成一束尖細(xì)、明亮而又

均勻的光斑，照射在樣品室內(nèi)的樣品上;透過樣品后的電子束攜帶有樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息，

樣品內(nèi)致密處透過的電子量少,稀疏處透過的電子量多;經(jīng)過物鏡的會(huì)聚調(diào)焦和初級(jí)放大后，

電子束進(jìn)入下級(jí)的中間透鏡和第1、第2投影鏡進(jìn)行綜合放大成像，被放大了的電子影

像投射在觀察室內(nèi)的熒光屏板上;熒光屏將電子影像轉(zhuǎn)化為可見光影像以供使用者觀察。

三、透射電鏡的結(jié)構(gòu)

透射電子顯微鏡由三大部分組成: 1、電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡體):照明源(電子槍聚光鏡)、

成像系統(tǒng)(樣品鏡、物鏡、中間鏡、投影鏡)、觀察記錄系統(tǒng)。2、真空系統(tǒng)。3、電源與控

制系統(tǒng)

四、超薄切片制備技術(shù)步驟

透射電鏡的成像是由一定強(qiáng)度的電子束透過標(biāo)本而成像。由于電子射線的穿透能力比較低，電鏡又具有很高的分辨率和放大率，因此, 電鏡標(biāo)本需要厚度在0.03～0.05μm的超薄切片，以獲得高分辨的超微結(jié)構(gòu)圖像。

超薄切片制作過程包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個(gè)環(huán)節(jié)。

（一）取材

取材是超薄切片技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于生物組織離體后，細(xì)胞將會(huì)立即釋放出各種水解酶引起細(xì)胞自溶，使細(xì)飽內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此，為盡可能避免產(chǎn)生人工假像，取材時(shí)有以下要求：

1． 取材要快，一般要求在1min內(nèi)把組織塊浸入固定液。

2． 組織塊要小，一般切成0.5～1.0mm。

3． 所用固定液及容器須預(yù)冷，以降低離體細(xì)胞內(nèi)水解酶的活性，盡可能減少細(xì)胞自溶。

4． 由于電鏡觀察視野小，具有很大的局限性，所以，選擇部位要準(zhǔn)確可靠。

5． 切割組織的刀、剪必須鋒利干凈，避免拉、鋸、壓等動(dòng)作造成細(xì)胞損傷。

（二）固定

1. 固定的作用 標(biāo)本固定在于：

①破壞細(xì)胞的酶系統(tǒng)，阻止細(xì)胞的自溶；

②穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分，如核酸、核蛋白，糖類和脂類，使之發(fā)生交聯(lián)，減少或避免抽提作用，以保存組織成分；

③在一些細(xì)胞組分之間以化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)建立交聯(lián)，以提供骨架來穩(wěn)定各種細(xì)胞器的空間構(gòu)型；

④能提供一定的電子反差。

2. 常用的固定劑　理想的固定劑須具備的條件有：

①能迅速滲入組織細(xì)胞內(nèi)，盡快固定細(xì)胞以減少組織自溶；

②能穩(wěn)定細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)成分，使其在脫水、滲透及包埋等過程中不溶解和丟失；

③避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)膨脹或收縮，以保證獲得真實(shí)結(jié)構(gòu)的電鏡圖像；

④能保存酶的活性以供電鏡細(xì)胞化學(xué)研究。目前尚未找到一種能滿足上述全部功能的理想固定劑，較理想和常用的固定劑有四氧~化鋨、醛類、高錳酸鉀等。

3. 固定方法　目前，用于生物樣品超薄切片技術(shù)的主要固定方法是化學(xué)固定法。采用戊二醛 (或戊二醛+多聚甲醛)固定l～3h后，經(jīng)相應(yīng)的緩沖液沖洗，再用1%鋨酸后固定1～2h。

生物樣品有多種多樣，對(duì)于不同的材料和組織部位，其固定方式是不同的。

（1）浸泡固定：適用于一些能允許在短時(shí)間內(nèi)停止供血而仍保持其功能和結(jié)構(gòu)的器官或組織，以及一些病理檢查的樣品。其方法是經(jīng)解剖 (或手術(shù))盡快從機(jī)體中取出所需組織，并按取材要求，把組織切成小塊，放入小瓶子內(nèi)作常規(guī)雙重固定。

（2）血管灌注固定：適用于取材較復(fù)雜或?qū)θ毖踺^敏感的器官或組織，須采用血管灌注固定?？筛鶕?jù)動(dòng)物的大小選用全身灌注或局部灌注的方式。

（3）培養(yǎng)細(xì)胞的固定：如所固定材料為微生物、單細(xì)胞原生動(dòng)物、細(xì)胞提取物或組織培養(yǎng)的細(xì)胞，則應(yīng)先離心倒去上面的培養(yǎng)液 (或上清液)，然后才按常規(guī)方法進(jìn)行雙重固定。戊二醛固定時(shí)間為15～30min，鋨酸固定時(shí)間為15～40min。

對(duì)于試管或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的單層細(xì)胞，在傾去培養(yǎng)液后，即加入前固定液，并輕刮下細(xì)胞，用2000r/min離心15～20min，使細(xì)胞成團(tuán)。然后傾去上清液，再緩慢加入新鮮的前固定液，以免將細(xì)胞團(tuán)沖散，并繼續(xù)進(jìn)行雙重固定。

4. 固定時(shí)注意事項(xiàng)

（1）固定液的濃度：固定液濃度要適宜。一般戊二醛常用濃度為1％～4％,鋨酸為1％～2％。

（2）固定液的滲透壓：固定液的滲透壓須調(diào)節(jié)到接近組織、細(xì)胞的生理值。固定液的滲透壓是通過改變緩沖液的濃度或者通過增加鈉、鈣和鎂等電解質(zhì)或葡萄糖和蔗糖等非電解質(zhì)來調(diào)節(jié)的。

（3）固定液的pH值：固定液pH值須接近所要固定組織的pH值。由于大部分動(dòng)物組織的平均pH值約7.4, 因此，電鏡固定液的pH值都選用中性 (7.2～7.4)。

（4）固定時(shí)的溫度 理論上，低溫能降低酶的活性，減少細(xì)胞自溶和胞內(nèi)物質(zhì)的抽提，因此，大部分樣品宜在0℃～4℃下固定。

（三）脫水

脫水是指用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織細(xì)胞中的游離水，因水分的存在會(huì)使組織結(jié)構(gòu)在電鏡高真空狀態(tài)下急劇收縮而遭破壞，另外包埋劑是非水溶性的，細(xì)胞中的游離水會(huì)影響包埋劑的浸透，因此，脫水是一個(gè)很重要的步驟。

（四）滲透與包埋

滲透和包埋的目的是取代活組織中的水分以及支持整個(gè)結(jié)構(gòu)，以便標(biāo)本有特定的機(jī)械性利于切片。

1. 常用包埋劑及配方　包埋劑種類頗多，目前普遍使用的是環(huán)氧樹脂。為改善包埋塊的切割性能，有時(shí)在環(huán)氧樹脂包埋劑配方中再加一些增塑劑，以調(diào)節(jié)包埋塊的韌性。

環(huán)氧樹脂包埋劑對(duì)細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的保存性能，聚合后體積收縮率較小，為2％～5％，而且在真空中能經(jīng)受較長(zhǎng)時(shí)間的轟擊。但它操作不大方便，反差較弱。

環(huán)氧樹脂的型號(hào)較多，常用Epon812、Spur樹脂(ERL-4206) 、TAAB812，還有國(guó)產(chǎn)的環(huán)氧樹脂618和600等。

2. 滲透與包埋步驟　樣品在*脫水后，即可進(jìn)入滲透。將樣品置于100％脫水劑及等量包埋劑的混合液中(室溫下30min或數(shù)h)；第二步是將樣品置于純包埋劑中(室溫6h或過夜),然后可行包埋: 將滲透后的樣品挑入已裝有包埋劑的多孔橡膠模板中，將包埋劑灌滿，放入標(biāo)簽，然后根據(jù)包埋劑聚合時(shí)所需的溫度及時(shí)間聚合，制成包埋塊。

（五）超薄切片

超薄切片的面積為0.5mm×0.5mm左右，要切出較理想的超薄切片，不僅超薄切片機(jī)質(zhì)量好，還要有滲透、包埋好的包埋塊，以及要有好的切片刀和操作者技術(shù)熟練等。其步驟是：

1. 定位、修塊　定位、修塊是指保留要進(jìn)行電鏡觀察部分，把其余部分削去，以利進(jìn)行超薄切片。

2. 制刀　用于超薄切片有鉆石刀和玻璃刀。玻璃刀因價(jià)格低廉而被常用。

玻璃刀經(jīng)檢查后的刀還須在刀上作一小水槽，以便在切片時(shí)讓切下來的超薄切片漂浮在液面上。為防止漏水，邊沿須用石蠟或指甲油焊封。在焊接時(shí)，應(yīng)注意刀刃不要粘上石蠟或其他的焊封劑，以免損傷刀刃。

3. 載網(wǎng)和支持膜制備　超薄切片須置于一種載網(wǎng)上才能進(jìn)行觀察。載網(wǎng)一般采用很薄的銅片，此外，還有鎳網(wǎng)、銀、鉬、不銹鋼、尼龍等材料制成的載網(wǎng)。

（六）超薄切片機(jī)

超薄切片機(jī)有熱膨脹式和機(jī)械進(jìn)刀式兩類，后者較常用，它是以微動(dòng)螺旋和微動(dòng)杠桿來提供微小進(jìn)刀而切出切片，如Leica超薄切片機(jī)。

（七）切片染色

（1）染色的作用：所謂電子染色是利用某些金屬鹽(如鉛、鈾、鋨等)能與細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)和成分結(jié)合，以增加其電子散射能力，進(jìn)而達(dá)到提高反差的一種方法，不同結(jié)構(gòu)成分上吸附有不同數(shù)量重金屬原子，結(jié)合重金屬原子較多的區(qū)域(即結(jié)構(gòu)致密、原子序數(shù)高的部分)具有較強(qiáng)的電子散射能力，在電鏡下呈現(xiàn)為電子致密的黑色；結(jié)合重金屬原子較少的區(qū)域則為淺黑色，灰黑色，沒有結(jié)合重金屬的區(qū)域是電子透明的區(qū)域，因此，經(jīng)過電子染色處理可提高樣品反差，增加圖像清晰度。