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代謝在細(xì)胞和生理過程中的作用已經(jīng)很明確，現(xiàn)在認(rèn)為許多疾病都與代謝功能障礙或重編程有關(guān)。安捷倫 Seahorse XF 技術(shù)簡化了細(xì)胞能量代謝分析。該技術(shù)利用免標(biāo)記方法實時測量活細(xì)胞的兩條能量代謝通路，量化細(xì)胞代謝表型，從而分析細(xì)胞功能的變化。

     XF 技術(shù)通過測定氧氣消耗速率(Oxygen Consumption Rate, OCR)來反映細(xì)胞線粒體的功能，通過測定細(xì)胞外酸化速率(Extra Cellular Acidification Rate，ECAR)來反映糖酵解功能。

     將細(xì)胞接種到孔中，并可以將多四種藥物（例如抑制劑或激動劑）自動添加到細(xì)胞中。在探針板中，每個探針?biāo)闹芘帕辛怂膫€集成的加藥口。將藥物依次注入孔中，并通過探針與檢測液混合。實時測定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝動態(tài)變化。

提問

Qustions&解答Answers

Seahorse XF 實驗常見問題及解答

01可以使用超出保質(zhì)期的探針板或重復(fù)使用探針板嗎？

     Agilent 無法保證因使用超出保質(zhì)期的探針板或重復(fù)使用探針板而得到的實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量(有效性)，為得到較佳的、較真實的數(shù)據(jù)，請使用有效期內(nèi)的探針板及其它消耗品。

02探針板水化超出水化時間怎么辦？

     Agilent建議將探針板放入37℃無CO2培養(yǎng)箱中水化過夜以得到較優(yōu)結(jié)果。短水化時間是37℃水化12小時。探針板長水化時間是37℃水化72小時，但由于液體蒸發(fā)需要補充(或更換)校準(zhǔn)液，因此37℃無CO2培養(yǎng)箱務(wù)必放置水盤保證濕度。

03Fluxpak各種探針板有什么區(qū)別？

     探針板是Fluxpak的組成部分，一個Fluxpak包含探針板、水化板、校準(zhǔn)液和細(xì)胞培養(yǎng)微孔板。以上各消耗品數(shù)量因所購Fluxpak類型而不同。探針板不能單獨訂購，必須通過訂購Fluxpak來購買，但細(xì)胞培養(yǎng)板和校準(zhǔn)液可單獨購買。訂購前，需要了解使用機器的型號及所需要的實驗次數(shù)，訂購與之配套的Fluxpak。

04計劃明天做實驗，我今天要做些啥？

     實驗前一天，打開主機，打開電腦，同時點開Wave軟件，確保是Connected的狀態(tài)，水化探針板，貼壁細(xì)胞提前接種到Seahorse的細(xì)胞培養(yǎng)板里。

05探針板水化聽說有二步，是這樣嗎？

     是的，96孔探針板，實驗前一天，用無菌水；第二天做實驗前，棄去無菌水，更換上37℃預(yù)熱好的校準(zhǔn)液，再放置無CO2恒溫箱孵育1小時，這樣二步法水化，較大程度避免了探針頭上的小氣泡；24機型探針板一步法水化即可，但是還是建議用之前手動排一下氣泡；

06一次實驗可以只使用探針板其中的一部分嗎？

     為了將所有藥物或化合物成功地注入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，Agilent建議水化整個探針板并因需要將相同字母標(biāo)注的全部加藥孔注入藥物（請參考實驗流程中關(guān)于加載藥物的注意事項）。背景孔的加藥孔也必須加上藥物，保證所有的A加藥孔體積一致，B、C、D孔同理，否則會造成打藥失??；

07實驗中為何必須設(shè)置背景校正孔？

     背景校正孔被用來過濾掉實驗的干擾因素，比如溫度和 buffering capacity，這些干擾因素會影響氧含量和pH變化（非來源于代謝變化的影響）。背景校正孔還能被用來修正整板間溫度波動，來診斷潛在溫度問題，以及作為實驗獲得非期望數(shù)據(jù)時原因篩查的切入點。

08背景校正孔怎么設(shè)置？

      背景校正孔里除了沒有細(xì)胞，其它所有操作和細(xì)胞孔一致。96機型背景校正孔（A1,A12, H1, H12，即4個角）不接種細(xì)胞；24機型背景校正孔設(shè)置為（A1, B4, C3, D6）；確保背景校正孔中只加入培養(yǎng)液（無細(xì)胞）

09為何細(xì)胞培養(yǎng)板需要在 37℃無CO2 培養(yǎng)箱中放置45-60min？

     細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃無CO2培養(yǎng)箱中孵育45-60min的目的是為了脫氣，釋放CO2。

10 Seahorse 實驗時，我擔(dān)心細(xì)胞量少，我多種點細(xì)胞可以嗎？

     細(xì)胞的密度需要摸索，在實驗上機前，長滿板底面積80-90%為較佳，設(shè)置一個密度梯度，找到較佳的密度；細(xì)胞過密會使檢測時形成的瞬間微室氧氣快速耗盡。

11 Seahorse 實驗，種細(xì)胞和平時種細(xì)胞有區(qū)別嗎？

      安捷倫細(xì)胞培養(yǎng)板種細(xì)胞時候，槍頭抵壁，與水平面呈45°角度加入，加完在超凈臺靜置1小時，有助于促進(jìn)細(xì)胞均勻分布并減少邊緣效應(yīng)。96孔細(xì)胞板種80ul；24機型的板子分二步，先每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)細(xì)胞1-6小時，細(xì)胞貼壁后，再補充生長培養(yǎng)基，每孔加入150μL生長培養(yǎng)液,總體積為250 μL。加液時沿壁輕輕加入，避免吹起剛貼壁的細(xì)胞。 

12 使用組織黏附劑處理細(xì)胞培養(yǎng)板會影響XF實驗測量嗎？

     不會。使用諸如poly-L-Lysine，fibronectin，Gelatin，poly-D-lysine，Cell-Tak™等組織黏附劑處理細(xì)胞培養(yǎng)板時，不會影響XF儀器測量的效果及實驗參數(shù)分析。

13 XFp/XFe96細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的每個細(xì)胞孔的大體積及底面積是多少？

       275 µL；底面積是正常96孔板底面積的40%。

14 XFe24細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的每個細(xì)胞孔的大體積及底面積是多少？

      1000 µL；底面積和正常96孔板底面積一樣大小。

15 Seahorse XF檢測液中需要加入抗生素嗎？

      無需加入抗生素，因為大部分XF實驗在幾小時內(nèi)就結(jié)束了。

16可以在Seahorse檢測液中加入血清嗎？

      不建議加入血清（如：FBS），因為其會影響檢測液的緩沖能力，并可能與進(jìn)行檢測的藥物/化合物發(fā)生非特異性結(jié)合而影響檢測效果，同時容易產(chǎn)生氣泡。另外，使用加入血清的檢測液溶解藥物加載至探針板加藥孔中進(jìn)行注射時，會出現(xiàn)漏藥或加藥注射失敗。

17加入底物的檢測液在多長時間內(nèi)可保持穩(wěn)定？或可以提前配好檢測液和藥物嗎？

      Seahorse檢測液在實驗當(dāng)天現(xiàn)用現(xiàn)配。藥物也要現(xiàn)配現(xiàn)用，溶解后的藥物要一次性用完，剩余的也不能用于下次實驗了。

18 Seahorse XF糖酵解壓力試劑盒中的藥物狀態(tài)看上去很奇怪，是否有質(zhì)量問題（或其他試劑盒中部分藥物）？

      如Glycolysis stress test kit中的2-DG，該藥可能是透明的液體、不透明的（白色的）固體，也可能是白色固體與透明液體的混合物，以上藥物狀態(tài)均不影響其性能，可按照說明書正常溶解使用。

19使用pH 7.4 的 XF DMEM 或 RPMI 基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備檢測液時，加上Seahorse的三個底物，是否就無需調(diào)整pH了？

      是的。使用推薦的 XF 三個底物，能確保分析培養(yǎng)基終 pH 值的準(zhǔn)確。如果使用其他供應(yīng)商提供的其他品牌的補充劑，則無法保證培養(yǎng)基pH 值的準(zhǔn)確。啟封后的pH7.4的DMEM或RPMI基礎(chǔ)培養(yǎng)基，盡可能在一個月內(nèi)用完，以免pH值因為空氣中的CO2進(jìn)去，影響pH值。

20Seahorse的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與其他廠家的有啥不同？

       Seahorse XF 培養(yǎng)基于 XF 分析，推薦研究者使用，以獲得較佳試驗結(jié)果。XF 培養(yǎng)基以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基組分（DMEM 或 PRMI）為基礎(chǔ)，做了以下這些方面改進(jìn)：

 無碳酸氫鹽和低緩沖容量：利于細(xì)胞外酸化率的檢測 

 無底物添加：適用于用戶的各種不同需求 

 低濃度酚紅或無酚紅：確保 pH 值測量的準(zhǔn)確性 

21請問進(jìn)行FAO實驗時，能夠在探針板上加載BSA-palmitate使其在上機測量時自動注射入細(xì)胞孔嗎？

      Agilent建議將BSA-palmitate或相似底物在培養(yǎng)細(xì)胞時做預(yù)處理。如果實驗存在合理依據(jù)需在上機測量時通過注射加BSA-palmitate、血清或其他類似底物，請聯(lián)系相關(guān)技術(shù)支持。

22 為何不能使用XF base medium配制的檢測液進(jìn)行Glycolytic rate與real-time ATP rate兩個實驗？

      XF base medium中含有酚紅，該物質(zhì)會影響這兩個實驗的測量。

23 為何不能使用GlutaMAX來代替Glutamine呢？

     不建議使用GlutaMAX來配制檢測液。因加入GlutaMAX后，還需細(xì)胞進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化為glutamine，這可能會影響線粒體對Glutamine氧化的動力學(xué)過程。

24 檢測液的pH對XF實驗非常重要嗎？

    是的，Seahorse XF實驗通過測定細(xì)胞代謝物（如：氧和質(zhì)子）的變化來確定OCR 和ECAR，而檢測液pH會影響這些代謝物的產(chǎn)生或消耗，因此保持檢測液一致的 pH（37℃，pH=7.4± 0.1）非常重要。

25 FluxPak中的水化板可以替代細(xì)胞培養(yǎng)板嗎？

      不可以，雖然水化板與細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)相同，但不能用來培養(yǎng)細(xì)胞。

26 Seahorse 探針板上機前加藥，需要注意什么？

       加藥時同樣方法，槍頭抵著加藥孔壁大約與水平面呈45°度角，將液體一次性加入到加藥孔中，注意板子始終保持在平面上，加完藥的探針板不能晃動，以免加入的液體漏入水化板中。（24的機型，在加藥前需要取下粉色的水化輔助板）；

27 Seahorse 細(xì)胞板上機時候，放進(jìn)去應(yīng)該就可以了？

       探針板和細(xì)胞板放入儀器時，朝向為A1孔朝向機器內(nèi)部，記得把蓋子拿掉；

28 Seahorse XF報告生成器中的代謝數(shù)據(jù)是如何計算的？

      在每個試劑盒的Seahorse XF報告生成器的用戶指南中詳細(xì)列出了數(shù)據(jù)的計算公式，請參閱。

29 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件Wave可以免費下載安裝嗎？

      是的，可在安捷倫找到Wave軟件下載，并且免費下載安裝。

30 Seahorse XF 儀器模板選項中沒有想檢測試劑盒的模板怎么辦？

     可在桌面板wave軟件中將相應(yīng)實驗?zāi)０逑葘?dǎo)出到 U 盤中，再導(dǎo)入XF 儀器模板庫即可。

31 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件導(dǎo)出選項中沒有對應(yīng)的report generator？

      當(dāng)軟件導(dǎo)出選項中無相應(yīng)的report generator時，請移步到Agilent細(xì)胞分析軟件下，下載wave分析軟件，也可以在對應(yīng)試劑盒的菜單中下載對應(yīng)的report generator。

32 Seahorse Wave 分析軟件，我的電腦怎么都安裝不上，怎么辦？

     當(dāng)軟件無法安裝時，可采用 Seahorse Analytics云分析， 這是一款網(wǎng)頁形式的 Seahorse XF 數(shù)據(jù)分析軟件，用戶可以通過任何一臺電腦安全地存儲、訪問和分析數(shù)據(jù)。較大地簡化了用戶的數(shù)據(jù)分析流程

33 Seahorse XF 實驗后，是否需要做歸一化處理呢，有哪些方法呢？

     功能生物數(shù)據(jù)的歸一化是原始數(shù)據(jù)展示和后續(xù)分析工作流程中的關(guān)鍵因素，以確保對結(jié)果的準(zhǔn)確一致的解析。XF 代謝分析在這方面也是如此，大多數(shù)實驗需要進(jìn)行某種形式的歸一化。無論是比較不同的細(xì)胞類型、基因修飾還是化合物處理，都必須根據(jù)共同的參數(shù)將數(shù)據(jù)歸一化以便正確比較。

     常用的方法，蛋白定量，細(xì)胞成像計數(shù)，核DNA的檢測等。

34 購買的Fluxpak包裝，為啥細(xì)胞板總是多幾塊呢？

    Agilent 充分考慮到實驗中的各種情況，如果你發(fā)現(xiàn)細(xì)胞種的過密了或者發(fā)生了污染，那么就需要更換新的細(xì)胞板重新鋪板。

35 Seahorse相關(guān)試劑存儲條件是怎么的呢？

      Agilent 基礎(chǔ)培養(yǎng)基類，請4℃避光保存，避免凍結(jié)。FAO和谷氨酰胺需要存放在-20℃；板子及常見的試劑盒，室溫存儲即可。

36 Seahorse XF 相關(guān)試劑盒的說明書在哪呢，有中文的嗎？

   Agilent 一直提倡遵循環(huán)保理念，當(dāng)您收到試劑盒后，標(biāo)簽面都有一個二維碼，掃描即可下載說明書。部分有中文說明書，請聯(lián)系相關(guān)技術(shù)支持索取。

37 Seahorse XFe24 組織胰島板能簡單介紹下嗎？

     目前只要24機型配有組織胰島微孔板，其微孔板的腔室容積為16.6 µL；

其網(wǎng)狀捕獲篩孔徑為125 µm。

38 Seahorse 啥數(shù)據(jù)能大致判斷實驗結(jié)果靠譜不？

      通過大量的結(jié)果數(shù)據(jù)，24機型基礎(chǔ)OCR值范圍50～400(pmol/min)，基礎(chǔ)ECAR值范圍20～120(mpH/min)；96機型基礎(chǔ)OCR值 范圍20～160(pmol/min)，基礎(chǔ)ECAR值范圍10～90(mpH/min)。這個范圍內(nèi)的值，還是比較靠譜的。

3 Seahorse  24/96 孔微孔板的尺寸是多少？