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Catalog No. B-P-00002-2、B-P-00002-4、B-P-00002-10

Specification 2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit

Storage 4℃保存、 保存兩年

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序

A、試劑準(zhǔn)備:

1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用37 ℃水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM等，用于稀釋A膠) 稀釋C緩沖溶液 (10 X) (貨號: B-P-00002-C)至C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。 (例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 如未使用完畢，可保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號: B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*溶解。再將37 ℃水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液取 0.5 mL，加至37 ℃已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)，配置成1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度，可降低A膠黏度。(單次使用，勿重復(fù)冷凍解凍 A膠 (1X) )

B、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)步驟

1、準(zhǔn)備適用24孔板的Transwell裝置(例如:康寧Transwell insert, 8 μm PET membrane)。

2、用37 ℃已回溫的C緩沖溶液 (0.5 X)將A膠 (1X) 原液體積稀釋5-20倍，建議一開始可選用15倍。 (根據(jù)細(xì)胞種類做稀釋比例對比實(shí)驗(yàn)，找出適合自己實(shí)驗(yàn)體系的稀釋倍數(shù)，稀釋倍數(shù)越高，膠體越軟，越容易穿透)

3、根據(jù)Transwell上室底部面積加入步驟2的 0.1 mL 稀釋后的A膠稀釋液到Transwell上室中。

4、將步驟4在 4 ℃ 冰箱孵育2-3小時。

5、在Transwell上室中加入0.1 mL 無血清的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞最終濃度約7.5 x 104 cells/well.。

6、在Transwell下室中加入0.8 mL 含10 %血清的細(xì)胞培養(yǎng)液做為chemoattractant，吸引細(xì)胞進(jìn)行遷移及分泌基質(zhì)蛋白酶 (MMP) 侵襲。 (對照組為Transwell下室中加入含0.8ml無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液)。

7、將細(xì)胞培養(yǎng)板在37 ℃, 5 % CO2培養(yǎng)箱孵育24-48 小時。

8、移除培養(yǎng)液，以PBS 清洗2次。

9、用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細(xì)胞。

10、加入1 ml 100 % 甲醇室溫固定30分鐘,再以PBS 清洗2次。

11、加入 1 ml 0.1 % 結(jié)晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 結(jié)晶紫) 室溫染色20 分鐘，再以PBS 清洗2次。

12、將Transwell移至載玻片上，在顯微鏡下隨機(jī)6-9個視野觀察計算遷移的細(xì)胞數(shù)